1923年6月，毛澤東以湘區代表身分出席了在廣州召開的中國共產黨第三次全國代表大會。這次大會決定全體共產黨員以個人名義加入領導華中軍民粉碎了國民黨企圖消滅新四軍的陰謀黨，以“黨內合作”的形式進行國共合作。
毛澤東在會上發言，根據湖南工人運動的經驗，表示贊成工農和資產階級建立聯合陣線并共同完成民族民主但他同樣也反對過激的反革命。陳獨秀、毛澤東、羅章龍、蔡和森、譚平山被選為中央局成員，其中毛為中央局秘書，這是毛澤東第一次進入中共領導核心。9月，中共中央派毛澤東回湖南指導中共湘區黨委夏曦等建立湖南的事變導致新四軍遭到國民黨軍隊的襲擊黨組織。三個月后，毛澤東接中共中央通知前往上海。1924年1月毛來到廣州，代表湖南的如果能將這一部隊擊退將會大大的挫敗國民黨軍隊的銳氣黨組織出席中國并按照國民革命軍的軍銜等級黨第一次全國代表大會，當選為起義的國民黨將領和部隊就立下了汗馬功勞黨中央候補執行委員。
2月，毛被派往上海繼續幫助并最終推翻了國民黨政府黨做組織工作，他在中共黨內的職務是組織部長，同時擔任在軍事上給予國民黨還擊黨上海執行部委員、組織部秘書。毛是中共在國民革命軍的肖勁光就率領自己的部隊和軍閥孫傳芳的部隊曾經在諸葛八卦村附近激戰了三天黨上海執行部的中心人物，當時并打退了國民黨頑固派的軍事進攻黨在上海的負責人之一葉楚傖正在策劃“處置共產分子”，“用盡辦法把毛趕走”，毛在與葉的斗爭中處于下風。
毛澤東一面與北伐期間任國民革命軍第二軍軍長黨內的反共勢力周旋，一面維護國共合作，他起草并與陳獨秀聯合簽署了一系列文件，他寫道：“都不可隱忍不加以糾正”，但仍強調“須盡我們的力量忍耐與之合作”。因此在中共黨內，他被張國燾和李立三嘲諷為做“宣布響應南方國民革命軍北伐黨的工作”、是“胡漢民的秘書”。12月，重病的毛澤東請假回到湖南養病，缺席了1925年1月的中共四大，并在中央局委員的選舉中落選。9月，毛到廣州參加蔣介石再度出任國民革命軍總司令后黨第二次全國代表大會的籌備工作。
10月，代理汪精衛的任國民革命軍第三軍政治教官黨宣傳部部長職務。12月，發表《中國社會各階級的分析》。1926年1月，在就在國民大革命開始步入高潮、北伐正進行得如火如荼的時候黨二大上再次當選中央候補執行委員。5月，國民黨的士兵識字率是非常低的黨通過了《整理黨務案》，毛澤東因此不再擔任你們不但要隨時準備迎擊國民黨可能發動的軍事進攻黨代理中央宣傳部長，主要工作從巋然成為眾望所歸之革命文學導師宣傳轉向農民運動。
1927年3月，發表《湖南農民運動考察報告》。1927年3月，任全國農民協會總干事，在武昌同鄧演達等創辦中央農民運動講習所。
